田甜 徐列明

【择要】目标 研讨DSG型生物信息红外肝病医治仪（BILT肝病医治仪）对小鼠肝脏微循环的影响。办法 将40只SPF小鼠造模后随机均分为未照射模子组、寒光源照射模子组、红外线照射模子组和BILT肝病医治仪照射模子组，另取20只正常小鼠作为比较。每组辨别以激光多普勒血流仪测定肝脏血流量并以显微活体视频技能察看肝脏微循环血流速率，同时举行肝脏病理学反省和血流清生化学反省。后果 BILT肝病医治仪照射模子组肝脏均匀血流贯注量与未照射模子组比力分明增长（P=0.004），而寒光源、红外线照射模子组与未照射模子组比均无分明增长血流量作用（P=0.713和0.465）；未照射正常组较未照射模子组小鼠肝脏微血管内红细胞均匀流速快,差别有统计学意义(P=0.001)；BILT肝病医治仪照射模子组肝脏微循环均匀流速较未照射模子组、寒光源照射模子组和红外线照射模子组的流速也有所增长，差别有统计学意义(P=0.004、0.020和0.030)。BILT肝病医治仪照射模子组AST活性较未照射模子组分明低落（P=0.027），该组羟脯氨酸（Hyp）均匀含量低于未照射模子组，但差别无统计学意义(P=0.433)。结论 BILT肝病医治仪可改进肝纤维化小鼠肝脏的微循环并低落肝纤维化小鼠血清AST活性，改进肝脏病理形态。

 【要害词】 纤维化；肝脏微循环；红外线；活体显微视频技能

DSG biological information infrared liver disease therapy instrument improves liver microcirculation in mice TIAN Tian ,XU Lie-ming. Institute of Liver Disease, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203,China

Corresponding author: XU Lie-ming, Email: >###.cn

【Abstact】  Objective    To investigate the effect of DSG biologic information infrared liver disease therapy instrument（BILT liver disease therapy instrument） on liver microcirculations in mice. Methods    Liver fibrosis was induced in 40 SPF mice which were randomized into 4 groups:without irradiation group, cold light irradiation group,infrared light irradiation group and BILT group（10 in each group）.Twenty 

healthy mice were taken as the control. Liver blood flow of each group was observed by laser-Doppler flow instrument, and blood  flow rate of liver microcirculation in each group was observed by intravital microscopy. Pathological examination and serum biochemistry were also performed. Results In fibrosis mice , the liver blood flow in average of BILT group was higher than that of without irradiation group (P =0.004),while  comparing with without irradiation group there were no significant differences in liver blood flows of the cold light irradiation group and infrared light irradiation group(P =0.713 and 0.465). Red blood cell velocity of microvessels in average of the healthy group (without irradiation) was higher than that in the without irradiation group of fibrosis mice (P =0.001),and it in the BILT     

###cma.j.issn.1674-2397.2009.01.007   

    基金项目：国度重点底子研讨开展方案（973方案）局部赞助项目（2006CB504800）；上海市重点学科建立赞助项目（Y0302）；上海市教诲委员会E-研讨院建立方案项目局部赞助项目（E03008）

作者单元：201203 上海西医药大学肝病研讨所（田甜、徐列明）；上海西医药大学隶属曙光医院肝硬化科 

上海西医药大学肝肾疾病病证教诲部重点实行室  上海市高校西医外科学E-研讨所（徐列明）

通讯作者：.徐列明，Email:>###.cn

group（fibrosis mice）was also higher than those in other groups of fibrosis mice（P =0.004,0.020 and 0.030）.For fibrosis mice, the averageAST in BILT group was lower than that in the without irradiation group(P =0.027),and the difference in hydroxyproline（Hyp）levels between the groups was not of statistical significance（P =0.433）.

Conclusion    BILT liver disease therapy instrument can improve the liver microcir-culation, reduce AST 

level and improve liver pathological state in mouse with fibrosis.

 【Key words】 Fibrosis; Liver microcirculation;Infrared rays; Intravital microscopy

 使用激光多普勒技能和显微活体视频技能，察看以活血化瘀原理研制的DSG型生物信息红外肝病医治仪（BILT肝病医治仪）对正常小鼠和肝纤维化模子小鼠肝脏微循环的影响，从“活血”改进微循环角度解释BILT肝病医治仪的作用。

1质料和办法

1.1  质料  昆明种雄性小鼠60只，体质量(30±5)g，SPF级，由上海西医药大学实行植物中心提供；四氧化碳(CCl₄)和橄榄油（剖析纯，国药团体化学试剂有限公司）；异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate isomer I，FITC，美国sigma公司）。PowerLab/4sp 激光多普勒血流仪和Chart 5.0 (Powerlab/4sp)记载和剖析软件（澳大利亚ADI公司）；医用寒光源（浙江医学仪器厂）；红外灯（江苏海门医疗东西公司）； BILT肝病仪（杭州鼎力神医疗东西有限公司）；MT-2荧光颠倒显微镜、CCD显微摄像和录像体系（Olympus 公司）。

1.2.  办法

1.2.1  造模  参照余万桂^[1]的办法创建小鼠肝纤维化模子：40只小鼠用20％CCl₄以5mg/kg颈部皮下注射，每5天注射1次，共6周。

1.2.2  分组与预备  小鼠被随机分为正常组（20只）和造模组（40只）。正常组小鼠再随机分为未照射正常组和BILT肝病医治仪照射正常组，每组10只。造模组小鼠造模后随机分为未照射模子组、寒光源照射模子组、红外线照射模子组和BILT肝病医治仪照射模子组，每组10只。承受照射的小鼠辨别装入自制小铁笼内，显露腹部肝脏投影区，距响应光源15cm，天天照射1次，每次15min。照射疗程为4周。疗程完毕后，各组随机分出5只举行激光多普勒血流量测定，余下5只以显微活体视频技能察看肝脏微血管和肝窦内血流速率。

1.2.3  激光多普勒血流仪测定肝脏微循环均匀血流贯注量用Chart 5.0 (Powerlab/4sp)记载和剖析软件记载小鼠肝脏均匀血流贯注量，每只小鼠记载10min。取5min后安稳段数据盘算其均匀值，失掉各组小鼠均匀血流贯注量。

1.2.4  活体显微视频技能观察肝脏微循环流速

1.2.4.1  荧光标志的红细胞制备  参照参考文献^[2] 中的办法。

1.2.4.2  活体植物测前预备  小鼠以2%戊巴比妥钠按2ml/kg剂量麻醉后，沿正中线剪开小鼠腹壁，拉出小鼠肝脏平铺于载玻槽玻片上，置Olympus颠倒荧灯光显示微镜下察看。

1.2.4.3  注射FITC标志红细胞并显微摄像设置拍摄像素为最小值，曝光工夫为60ms，使拍摄速率到达最快。从下腔静脉注射FITC标志的红细胞0.05ml，在显微镜下找到符合的察看部位，然后切换到电脑上细心察看微血管和肝窦内血流情况并数码录像，用视频处置软件比力各组间微循环血流速率的差别。

1.2.4.4  图象处置  用Image-pro plus 6.0软件处置视频图像，寻觅直径在20mm以下微血管内符合的荧光标志的红细胞举行追踪。每个视频至多找出3个FITC标志红细胞的轨迹取均匀值，保管和记载各轨迹数据及图象，本体系按最快10桢/s盘算，经过追踪FITC标志红细胞的两桢图象之间活动的间隔和工夫盘算其在微血管内的活动速率。

1.2.5  样本的收罗与处置  用激光多普勒血流仪测定每组小鼠肝脏均匀血流贯注量后，摘眼球采血，4℃下静置2h，离心半径9.4cm,3000r/min离心15min，取上清液分装于1.5ml离心管内，-70℃高温保管；植物采血正法后，取下肝脏切取约1.0cm´0.8cm´0.3cm巨细肝构造，10%中性甲醛牢固，24h后逐级酒精脱水，二甲苯通明，56℃白腊包埋，4µm厚切片，用于HE和胶原染色。

1.2.6  肝脏构造学察看  依照本研讨所订定的胶原纤维增生水平的半定量尺度^[3]，镜下察看各组肝构造胶原染色片，判别肝纤维化的水平。各肝构造样本举行胶原纤维染色后，用图象定量剖析体系扫描，读取胶原染色阳性面积百分比，取每张切片5个视野的均匀值，举行胶原纤维增生水平的半定量统计剖析。

1.2.7  血清生化学检测  ALT和AST活性的检测接纳赖氏法；Alb含量的测定接纳溴甲酚绿法；TBil含量的测定接纳苯甲酸钠—咖啡因比色法，上述检测均由曙光医院查验科完成。

1.2.8  肝构造羟脯氨酸（Hyp）测定  接纳Jamall法^[4]测定。

1.3  统计学办法  用SPSS13.0统计软件包举行统计剖析。定量材料的数据剖析接纳单要素方差剖析(ANOVA)，后果以`X±S表现，定性品级材料的数据剖析接纳Ridit剖析，统计查验水准a =0.05。

2  后果

2.1  BILT肝病医治仪对肝纤维化小鼠肝脏微循环的影响

2.1.1  激光多普勒血流测定肝脏微循环均匀血流贯注量  未照射模子组肝脏均匀血流贯注量较未照射正常组略低，差别无统计学意义（P=0.679） BILT肝病医治仪照射正常组的目标略高于未照射正常组，差别无统计学意义（P=0.142）；BILT肝病医治仪照射模子组肝脏血流量与未照射模子相比分明增长（P=0.004），而别的光源作用于造模组后与未照射模子相比均无分明增长血流量作用(P=0.713和0.465)（表1）。

表1. 差别光源处置后各组小鼠肝脏均匀血流贯注量（`X±S）

注： 与未照射模子组比，^aP=0.0

04

2.1.2  活体显微视频技能观察肝脏微循环流速

1.2.2.1  镜下察看  正常小鼠肝脏外表血管丰厚，肝窦以肝小叶中间静脉为中心呈麋集的树枝状散布于其四周，在2个肝小叶间，毛细血管互相符合，血管界限明晰，血流向中间静脉活动（图1a）。各模子组与正常组小鼠肝脏微循环流速比力均分明减慢；BILT肝病仪照射模子组小鼠肝脏微循环流速虽也较正常组分明减慢，但比未照射模子组微循环流速快。各模子组小鼠均可见肝脏微血管数分明增加，肝小叶间微血管数希罕，血管四周有小泡状透亮影，血管内可见大批标志的红细胞收集和黏附（图1b）。

2.1.2.2  图象处置后的数据剖析  正常组及造模组视频处置后图像见图2，各组小鼠肝脏内微血管内红细胞流速比力见表2。未照射正常组与未照射模子组小鼠肝脏内微循环流速比力差别有统计学意义（P=0.001）；寒光源照射模子组、红外线照射模子组与未照射模子组小鼠肝脏微血管红细胞流速比力差别无统计学意义（P=0.909和0.925），BILT肝病医治仪照射模子组微血管内红细胞流速较未照射模子组、寒光源照射模子组、红外线照射模子组增长，差别均有统计学意义（P=0.004、0.020和0.030）。

   注:(1a)正常小鼠肝脏微血管，（1b）模子小鼠肝脏微血管，箭头所示为荧光标志的红细胞；

(2a)正常小鼠，(2b)模子小鼠，图中直线所示为红细胞活动轨迹。

图1  正常小鼠和模子小鼠肝脏微血管Х200  图2  正常组和模子组小鼠肝脏微循环顾频处置后的图像及轨迹

Fig1  Hepatic microvasculars of healthy mice and fibrosis mice Х200

Fig2  Video images and tracks of hepatic microciculation in healthy and fibrosis mice

 

表2. 差别光源照射后小鼠肝脏微血管内红细胞流速（`X±S ）

Table2  Red blood cell velocity of hepatic microvessels of mice treated by different light sources（`X±S ）

.2  各组小鼠肝脏病理学察看

2.2.1  大要察看  造模完毕时模子小鼠较正常组小鼠分明萎靡、毛发紊乱。正常组和BILT肝病医治仪照射正常组小鼠肝脏外表平滑、质软、色红褐；未照射模子组及承受差别光源照射的模子组小鼠肝脏均可见差别水平的肿胀，肝外表呈颗粒状，质较硬，色暗。

2.2.2  肝构造HE染色察看  未照射正常组和BILT肝病医治仪照射正常组小鼠的肝小叶布局正常，肝细胞在中间静脉四周呈放射状分列，无分明变性坏去世或炎性细胞浸润；各模子组小鼠肝细胞均有差别水平的细胞质松散；未照射模子组镜下可见中间静脉收集，呈现“辐辏征象”；寒光源照射模子组有大批散在肝细胞核空泡变性，肝细胞细胞质松散分明；红外照射模子组少量肝细胞细胞质松散；BILT肝病医治仪照射模子组仅有大批肝细胞细胞质松散（图3）。

2.2.3  肝构造胶原纤维增生的半定量剖析  正常组小鼠肝构造无纤维构造增生；各模子组小鼠肝构造汇管区扩展结缔构造增生，向小叶内舒展，构成不完全距离及一般绵薄的完全距离（图4）。肝构造胶原纤维增生的半定量剖析表现：未照射模子组与未照

射正常组比力差别有统计学意义（P=0.06），BILT肝病仪照射模子组5例评级均为Ⅱ

    注：（a）未照射正常组；（b）BILT肝病医治仪照射正常组；（c）未照射模子组；（d）寒光源照射模子组；（e）红外线照射模子组；（f）BILT肝病医治仪照射模子组

图3. 差别光源照射后小鼠肝构造炎性反响变革HEХ200

Fig3  Inflammation in liver tissues of mice treated by different light sources HE ×200

   注：（a）未照射正常组；（b）BILT肝病医治仪照射正常组；（c）未照射模子组（d）寒光源照射模子组；（e）红外线照射模子组；（f）BILT肝病医治仪照射模子组

图4差别光源照射后各组小鼠肝构造胶原纤维堆积变革 天狼猩红染色´100

Fig4 Collagenous fibre deposit in liver tissues of mice treated by different light sources

Sirius red stain´100

级，但与未照射模子组比力差别无统计学意义，承受差别光源照射模子组之间比力差别无统计学意义（表3）。

 

表3 差别光源照射小鼠的胶原纤维增生状况（Ridit剖析）

   注：与未照射正常组比力，^aP=0.006

2.2.4  胶原纤维增生水平图像处置剖析  未照射模子组小鼠胶原纤维染色的阳性面积比与未照射正常组比力分明增大(P=0.007)；BILT肝病医治仪照射模子组小鼠胶原纤维染色的阳性面积比与未照射模子组分明减小（P=0.001）；寒光源照射模子组、红外线照射模子组的小鼠胶原纤维染色的阳性面积比则与未照射模子组无分明差异（P=0.480和0.133）（表4）。

 

表4  组小鼠肝构造纤维增生的半定量剖析（`X±S ）

   注：与未照射正常组比,a P=0.007；与未照射模子组比力, ^bP=0.001

 

2.3  血清生化检测后果

2.3..1  各组小鼠血清ALT、AST、TBiL及Alb值

.2  各组小鼠肝脏病理学察看 2.2.1  大要察看  造模完毕时模子小鼠较正常组小鼠分明萎靡、毛发紊乱。正常组和BILT肝病医治仪照射正常组小鼠肝脏外表平滑、质软、色红褐；未照射模子组及承受差别光源照射的模子组小鼠肝脏均可见差别水平的肿胀，肝外表呈颗粒状，质较硬，色暗。 2.2.2  肝构造HE染色察看  未照射正常组和BILT肝病医治仪照射正常组小鼠的肝小叶布局正常，肝细胞在中间静脉四周呈放射状分列，无分明变性坏去世或炎性细胞浸润；各模子组小鼠肝细胞均有差别水平的细胞质松散；未照射模子组镜下可见中间静脉收集，呈现“辐辏征象”；寒光源照射模子组有大批散在肝细胞核空泡变性，肝细胞细胞质松散分明；红外照射模子组少量肝细胞细胞质松散；BILT肝病医治仪照射模子组仅有大批肝细胞细胞质松散（图3）。 2.2.3  肝构造胶原纤维增生的半定量剖析  正常组小鼠肝构造无纤维构造增生；各模子组小鼠肝构造汇管区扩展结缔构造增生，向小叶内舒展，构成不完全距离及一般绵薄的完全距离（图4）。肝构造胶原纤维增生的半定量剖析表现：未照射模子组与未照 射正常组比力差别有统计学意义（P=0.06），BILT肝病仪照射模子组5例评级均为Ⅱ     注：（a）未照射正常组；（b）BILT肝病医治仪照射正常组；（c）未照射模子组；（d）寒光源照射模子组；（e）红外线照射模子组；（f）BILT肝病医治仪照射模子组 图3. 差别光源照射后小鼠肝构造炎性反响变革HEХ200 Fig3  Inflammation in liver tissues of mice treated by different light sources HE ×200    注：（a）未照射正常组；（b）BILT肝病医治仪照射正常组；（c）未照射模子组（d）寒光源照射模子组；（e）红外线照射模子组；（f）BILT肝病医治仪照射模子组 图4差别光源照射后各组小鼠肝构造胶原纤维堆积变革 天狼猩红染色´100 Fig4 Collagenous fibre deposit in liver tissues of mice treated by different light sources Sirius red stain´100 级，但与未照射模子组比力差别无统计学意义，承受差别光源照射模子组之间比力差别无统计学意义（表3）。   表3 差别光源照射小鼠的胶原纤维增生状况（Ridit剖析）    注：与未照射正常组比力，aP=0.006 2.2.4  胶原纤维增生水平图像处置剖析  未照射模子组小鼠胶原纤维染色的阳性面积比与未照射正常组比力分明增大(P=0.007)；BILT肝病医治仪照射模子组小鼠胶原纤维染色的阳性面积比与未照射模子组分明减小（P=0.001）；寒光源照射模子组、红外线照射模子组的小鼠胶原纤维染色的阳性面积比则与未照射模子组无分明差异（P=0.480和0.133）（表4）。   表4  组小鼠肝构造纤维增生的半定量剖析（`X±S ）    注：与未照射正常组比,a P=0.007；与未照射模子组比力, bP=0.001   2.3  血清生化检测后果 2.3..1  各组小鼠血清ALT、AST、TBiL及Alb值  未照射正常组与模子组比力ALT、AST活性及TBil、Alb含量差别无统计学意义；BILT肝病医治仪照射模子组的AST活性较未照射模子组分明低落，差别有统计学意义（P=0.027）；寒光源照射模子组和红外线照射模子组AST活性均与未照射模子组无分明差异；各模子组间ALT活性及TBil、Alb含量无分明差别。（表5） 2.3.2 各组小鼠肝构造Hyp含量  未照射模子组的Hyp均匀含量比未照射正常组增长，差别有统计学意义（P=0.007），阐明造模是乐成的。BILT肝病医治仪照射模子 表5  各组肝肝纤维化小鼠血清ALT、AST活性及Tbil、Alb含量的影响（`X±S ）   注：与未照射模子组比，aP=0.027 组的Hyp均匀含量比未照射模子组肝构造稍低，但差别无统计学意义，寒光源照射模子组、红外照射模子组和BILT肝病仪照射模子组之间Hyp含量的差别也无统计学意义（表6）。 表6 差别光源对肝纤维化小鼠肝构造Hyp含量的影响（`X±S ）    注：与未照射模子组比，aP=0.007 3  讨论    肝纤维化是种种慢性肝炎病理变革的紧张特性之一,是种种慢性肝炎向肝硬化开展的必经病理心理阶段。饶娴宜等[5]于20世纪80年月提出“肝微循环停滞是病毒性肝炎发病的病理心理底子”，以为在各型肝炎的整个历程中均存在着差别水平的肝脏微循环停滞，改进微循环是医治病毒性肝炎的紧张关键。鉴于肝纤维化历程中肌成纤维细胞紧缩与微循环停滞的构成和开展有着亲密联系，因而经过改进肝脏微循环是抗肝纤维化医治的紧张步伐，关于逆转肝纤维化具有紧张的临床意义。    国际学者颠末多年研讨，把西医的“瘀血”与肝纤维化联系在一同，以为肝纤维化是“瘀”，因而“活血化瘀”可以到达抗肝纤维化的目标[6]。假如把活血化瘀作用有限在促进血液循环方面，那么热能和机器能等物理作用也有相似的活血化瘀作用。BILT肝病医治仪的治病原理切合西医的活血化瘀机制，用红外线透射构造，使肝区部位取得红外波能量，改进肝细胞膜的通透性，使肝血窦的血流量增长。 为察看BILT肝病医治仪对肝纤维化的医治作用，本文用CCl4诱导小鼠复制肝纤维化植物模子。与未照射正常组比力，未照射模子小鼠的AST活性和TBil含量有所降低但差别不明显，同时使用多普勒技能看不到未照射模子组小鼠的肝脏均匀贯注量有分明变革。这些阴性后果的发生大概与选择的小鼠品系有关。     本实行表现，肝纤维化模子小鼠承受BILT肝病医治仪照射后，肝脏病理改动较轻，仅有大批肝细胞变性，胶原显微半定量剖析表现肝纤维化水平5例全为II级，为造模各组中最轻者，但差别无统计学意义，大概与样本量少有关。胶原纤维增生半定量剖析表现，BILT肝病医治仪照射模子组小鼠胶原纤维染色的阳性面积比力未照射模子组分明减小，差别有统计学意义。该组肝Hyp含量在造模各组中也是最低，虽与其他组别Hyp含量无统计学差别，但提醒具有改进肝纤维化的趋向。BILT肝病医治仪可分明低落肝纤维化模子小鼠血清AST活性，与未照射模子组比力有分明差别。肝纤维化小鼠经BILT肝病医治仪照射后，肝脏微循环流量和流速分明增长，较未照射模子组差别明显，但未发明其对正常组发生影响。寒光源和红外线照射肝纤维化小鼠，无论是肝脏病理、肝脏各生化目标，照旧肝脏微循环，其发生的影响和未照射模子组相比差别均无统计学意义。    比年来，非药物疗法在国际外遭到普遍存眷，其好处在于用物理学原理医治肝脏疾病，制止了药物在代谢历程中对肝、肾潜伏的不良反响。BILT肝病医治仪作为帮助医治手腕，操纵复杂，利用利便，可制止因利用过多药物而增长对肝脏的包袱。该仪器宁静性好，与患者医治部位无间接打仗，制止了交织熏染的大概性，将是一种有出路的非药物医治肝病办法，值得临床推行。   志谢  本文接纳的活体显微视频技能失掉深圳南山医院齐柯主任的协助，特表谢意。                            参 考 文 献 [1]Yu WG, Zhang HW, He SR. Effects of panax notoginseng saponins on TGF-ß1 and IL-1 in mice serum with liver fibrosis. Shizhen Guoyi Guoyao,2006,17(1):54-55(in chinese) 余万桂，张恒文，贺尚荣，三七总皂苷对肝纤维化小鼠血清直达化生长因子-ß1及白介素-1的影响。时珍国医国药，2006,17(1):54-55 [2] Zheng XX, Chen HF.Microcirculation blood flow quantitative measurement system[D].Zhejiang University,2002(in chinese) 郑筱祥，陈鸿峰，微循环流速的定量测试体系[D]。 浙江大学，2002 [3] Xu LM,Liu P,Liu C ,et al. Effect of extract from semen persical on experimental hepatic fibrosis. Zhongguo Zhongyao Zazhi,1994,19(8):491-494.(in chinese) 徐列明，刘平，刘成，等。桃仁提取物抗实行性肝纤维化的作用察看。中国中药杂志，1994,19(8):491-494. [4] Jamall IS ,Finelli VN, Que Hee SS. A simple method to determine nanogram levels of 4-hydroxyproline in biological tissues Anal Biochem 1981,112(1):70-75 [5] Rao XY, Su L,Wang XX,et al.Hepatic microcirculatory disturbance contributes to the pathophysiological basis of viral hepatitis. Yixue Wenxuan,1984,3(1):17-27(in chinese)    饶娴宜，苏涟，王秀霞，等。肝微循环停滞是病毒性肝炎发病原理的病理心理底子。医学当选，     1984,3(1):17-27 [6] Zhou Y,Gu J,Xu LM.Effects of Salvianolic acid B on elevated portal pressure and hepatic endothelin-1 level in rat model of hepatocirrhosis. Zhongguo Zhongxiyi Jiehe Xiaohua Zazhi,2007,15(1):4-7.(in chinese) 周杨，顾杰，徐列明。丹参酚酸B盐对肝硬化大鼠门静脉高压及肝构造中内皮素-1的影响。中国中中医联合消化杂志。2007,15(1):4-7.                       （收稿�>###�                        （本文编辑：黄建荣）